Thí nghiệm Ecupro đối với bệnh TPD - Thuốc Thủy sản Tân Hoàng Long

I. BỆNH TPD LÀ GÌ, MÔ TẢ SẢN PHẨM ECUPRO
Bệnh mờ đục hậu ấu trùng (TPD – Translucent post-larva disease) TPD đã được xác định do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra. Khi bị nhiễm bệnh cơ thể tôm trở nên trong suốt mờ đi, kèm theo trạng thái hôn mê và giảm hoạt động. Điều này dẫn đến tỷ lệ sống giảm và ảnh hưởng đến hiệu suất tăng trưởng của tôm. Tỷ lệ chết lên đến 80 tới 100% trong vòng 24 đến 48 giờ ở giai đoạn hậu ấu trùng (PL 2 đến PL 4)
Mô tả sản phẩm: ECUPRO
ECUPRO là sản phẩm kết hợp giữa vi sinh và enzyme, giúp tăng khả năng ức chế mầm bệnh Vibrio sp ảnh hưởng đến nuôi trồng thủy sản. Ngoài việc ức chế mầm bệnh, ECUPRO còn cải thiện khả năng tiêu hóa thức ăn và hấp thu chất dinh dưỡng. Việc bổ sung men vi sinh vào thức ăn làm tăng số lượng vi khuẩn có lợi trong ruột và cải thiện tiêu hóa ở tôm. Probiotic trong sản phẩm tạo ra các chất chuyển hóa thứ cấp có tác dụng chống lại mầm bệnh Vibrio sp và làm giảm các bệnh khác. Các enzyme trong sản phẩm giúp thủy phân các chất dinh dưỡng chính như carbohydrate, protein và chất béo thành dạng dễ hấp thụ trong ruột.
II. CÁC THÍ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA ECUPRO ĐỐI VỚI BỆNH TPD TRÊN TÔM
Chuẩn bị dịch nổi ECUPRO và nuôi cấy vi khuẩn vibrio
– Chuẩn bị dịch nổi từ ECUPRO: ECUPRO dạng bột được nuôi cấy trong môi trường lỏng SCDM ở 37OC trong 24 giờ, sau đó lấy hỗn hợp này ly tâm 10000 vòng trong 10 phút ở nhiệt độ 25oC. Hút phần dịch nổi phía trên lọc qua phễu lọc vô trùng có đường kính lỗ 0,22 µm rồi bảo quản ở nhiệt độ 4OC trong thời gian không quá 24 giờ trước khi bắt đầu thí nghiệm.
– Nuôi cấy Vibrio: Vibrio phân lập từ tôm bệnh được nuôi trong môi trường TSB (có bổ sung 2% NaCl) ở 25OC trong 24 giờ, tăng sinh vi khuẩn tới mật độ 1 × 10^9.
1. Thí nghiệm kiểm tra hoạt lực đối kháng của ECUPRO đối với Vibrio phân lập từ tôm bị nhiễm TPD
Đây là thí nghiệm định tính nhằm xác định khả năng ức chế mầm bệnh Vibrio (chủng Vibrio phân lập từ tôm nhiễm bệnh TPD được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc) của sản phẩm ECUPRO dựa vào vòng vô khuẩn trên đĩa thạch tương tự phương pháp kháng sinh đồ nhưng sử dụng các giếng chứa dịch nổi của ECUPRO thay vì sử dụng đĩa giấy tẩm kháng sinh.
* Mô Tả Thí nghiệm:
Tiến hành thí nghiệm:
Dùng 100µl dung dịch vi khuẩn đã chuẩn bị cấy trang lên đĩa thạch.
Đặt 6 giếng thử nghiệm vào đĩa thạch trên bao gồm 5 giếng có chứa lần lượt 20 ul, 40 ul, 60 ul, 80 ul, 100 ul phần dịch nổi ECUPRO và 1 giếng đối chứng 20 ul môi trường canh TSB
Ủ đĩa thạch ở 25 OC trong 24 giờ. Sau 24 giờ đọc kết quả đo và ghi nhận lại kích thước vòng vô khuẩn
Kết quả:
Bảng 1: Kết quả kích thước vòng vô khuẩn đo được
Kết luận:
Dựa vào kết quả thí nghiệm cho thấy
– Ở giếng đối chứng không tạo ra vòng vô khuẩn trên đĩa thạch, vi khuẩn phát triển bình thường
– Các giếng có chứa dịch nổi ECUPRO tạo vòng vô khuẩn, vi khuẩn không thể phát triển ở vùng xung quanh các giếng này, và kích thước vòng vô khuẩn tăng dần theo sự gia tăng thể tích dịch nổi ECUPRO cho vào giếng
Từ kết quả trên cho thấy ECUPRO có khả năng ức chế hiệu quả vi khuẩn vibrio gây bệnh TPD thí nghiệm.
– Ở đĩa thạch có pH = 7,0 cho thấy sản phẩm hoạt động tốt hơn, chứng tỏ sản phẩm phát triển tốt ở pH trung tính và kiềm trong quá trình nuôi tôm. – Sản phẩm ECUPRO sử dụng hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản do độ pH trong quá trình nuôi trồng thủy sản luôn ở mức ổn định từ pH 7.5-8.5 – Việc sử dụng kết hợp enzym và men vi sinh sẽ rất hữu ích trong việc kiểm soát sự lây lan của bệnh
2. Thí nghiệm định lượng đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn vibrio bằng dịch nổi ECUPRO sử dụng phương pháp ELISA và Resazurin
2.1 Thí nghiệm định lượng đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn vibrio bằng dịch nổi ECUPRO sử dụng phương pháp ELISA
Đây là thí nghiệm định lượng nhằm xác định khả năng ức chế mầm bệnh Vibrio (chủng Vibrio phân lập từ tôm nhiễm bệnh TPD được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc) của sản phẩm ECUPRO dựa vào chỉ số OD đo được trên máy đọc ELISA
Mô Tả Thí nghiệm:
Tiến hành thí nghiệm:
Pha loãng phần dịch nổi đã chuẩn bị vào môi trường canh TSB theo bảng sau
Bảng 2:
Sử dụng 100µl hỗn hợp ở mỗi độ pha loãng từ bảng 2 cho vào đĩa 96 giếng cùng với 50 µl dung dịch vibrio đã được chuẩn bị để tạo thành hỗn hợp có độ pha loãng được trình bày ở bảng 3. Ủ đĩa 96 giếng ở 28 OC. trong 24 giờ và đọc kết quả bằng máy đọc ELISA–Biorad ở bước sóng 595 nm
Bảng 3:
Hình: Đĩa 96 thử nghiệm khả năng kháng vibrio của ECUPRO bằng phương pháp ELISA
Ghi chú:
MC: Các giếng đối chứng sử dụng canh TSB
VC: Các giếng đối chứng chứa dung dịch Vibrio trong môi trường canh TSB
X; giếng để trống
0-100: các giếng chứa hỗn hợp dịch nổi ECUPRO và vibrio dung thử nghiệm
Kết quả:
Kết Quả OD đọc được từ đĩa 96 giếng thí nghiệm
Kết quả:
Dựa vào kết quả OD đo được từ đĩa 96 giếng cho thấy
– Mật độ quang tăng dần theo sự gia tăng độ pha loãng của dịch nổi ECUPRO (từ các giếng số 6 đến các giếng 11) điều này đồng nghĩa với việc gia tăng sự phát triển của vi khuẩn vibrio thí nghiệm
– Ở các giếng có nồng độ ECUPRO càng cao (các giếng số 6 độ pha loãng 1,5D tương đương với nồng độ dịch nổi ECUPRO 100 µl) có mật độ quang thấp nhất, chứng tỏ vibrio bị ức chế phát triển mạnh nhất.
– Khả năng ức chế phát triển của vibrio giảm dần theo mức độ giảm nồng độ của dịch nổi ECUPRO
– Ở độ pha loãng 1,5D – 3,75D tương đương với nồng độ dịch nổi ECUPRO 100 µl – 40 µl cho thấy khả năng ức chế vi khuẩn vibrio hiệu quả và khả năng này giảm ở độ pha loãng 1,5 xuống 0 tương đương với nồng độ dịch nổi ECUPRO 40 µl trở xuống.
2.2 Thí nghiệm định lượng đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn vibrio bằng dịch nổi ECUPRO sử dụng phương pháp nhuộm Resazurin
Đây là thí nghiệm định lượng nhằm xác định khả năng ức chế mầm bệnh Vibrio (chủng Vibrio phân lập từ tôm nhiễm bệnh TPD được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc) của sản phẩm ECUPRO sử dụng thuốc nhuộm màu tím (Resazurin) để nhuộm màu các tế bào vi khuẩn sống, quan sát sự chuyển đổi Resazurin thành resorufin (màu huỳnh quang hồng) bằng cách quan sát sự thay đổi màu dung dịch ở các giếng thí nghiệm
Tiến hành thí nghiệm:
Pha loãng phần dịch nổi đã chuẩn bị vào môi trường canh TSB theo bảng 3
Thành phần các giếng thí nghiệm được trình bày theo bảng 4
Bảng 4:
Kết Quả
Hình: Đĩa 96 thử nghiệm khả năng kháng vibrio của ECUPRO bằng phương pháp nhuộm Resazurin sau 24h.
Ghi chú:
– MC (giếng 1 – 2): Đối chứng âm chứa môi trường canh TSB + thuốc nhuộm resazurin – VIB giếng 3 – 4: Đối chứng dương Vibrio mật độ 1×109) + thuốc nhuộm resorufin – X (giếng 5 và 12): Trống – Marked Pro (giếng 6 – 11): 100µl dịch nổi ECUPRO + 50µl Vibrio + 30µl thuốc nhuộm resazurin
Dựa vào màu sắc trên đĩa 96 giếng sau 24 giờ thí nghiệm cho thấy
– Dịch nổi ECUPRO có khả năng ức chế gần như hoàn toàn tế bào vi khuẩn Vibrio ở độ pha loãng 1,5D – 3,5D (giếng 6 đ ến 9)
– Các giếng 10 – 11 (độ pha loãng 7,5 D đến 0 D) có màu hồng (màu thuốc nhuộm resorufin), chứng tỏ vẫn còn các tế bào vibrio sống sót đ ã sử dụng thuốc nhuộm Resazurin và chuyển đ ổi chúng thành resorufin
2.3 Kết Luận về 2 thử nghiệm định lượng ELISA và Nhuộm màu Resazurin
– Từ 2 thí nghiệm trên cho thấy các mẫu dịch nổi ECUPRO có khả năng ức chế chủng Vibrio thử nghiệm. – Nồng độ ECUPRO càng đậm đặc thì sự phát triển của vibrio càng thấp – Nồng độ ức chế tối thiếu Vibrio mật độ 1×10^9 cfu/50µl của dịch nổi ECUPRO là ở độ pha loãng 3,75 D (sử dụng 40 µl)
III PHẦN KẾT LUẬN TỪ CÁC THÍ NGHIỆM
– Hỗn hợp enzyme và probiotic từ sản phẩm ECUPRO có khả năng ức chế hiệu quả sự phát triển của vibrio gây bệnh TPD thử nghiệm. – Có thể sử dụng Probiotic kết hợp enzyme để tăng cường khả năng miễn dịch của tôm nuôi chống lại vi khuẩn vibrio gây bệnh trên tôm nuôi. – Bổ sung dinh dưỡng khoáng có thể kiểm soát sự phát triển của mầm bệnh
Thanh Long (s.t) 27/08/2024.

Đăng nhập